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    細胞學堂 | 一文了解細胞爬片制作全過程

    更新時間:2024-04-17  |  點擊率:153


    圖片

    細胞爬片是一種將細胞培養在玻璃或塑料表面上,使其附著并擴展的技術。一般是讓玻片浸在細胞培養基內,使細胞在玻片上生長。這種技術可以用于觀察細胞形態、運動、細胞與細胞之間相互作用等。利用細胞爬片進行體外實驗可排除體內諸多干擾因素的影響,方便對細胞進行各種干預處理。


    我們在做免疫熒光(IF)、原位雜交(FISH)、凋亡檢測(TUNEL)等實驗時,都需要制備細胞爬片,而爬片質量會影響到最后的圖片呈現效果以及實驗數據的精準性。本期細胞學堂為大家整理了細胞爬片的制作步驟及注意事項,幫助您快速上手開展實驗。





    操作步驟


    01

    爬片準備

    1

    根據實驗選擇合適大小的爬片。

    2

    爬片處理,首先浸酸:5%稀鹽酸浸泡過夜(最好逐片浸入,多片同時浸入會引起多片粘連、浸洗不充分),第二天先用自來水沖洗20次,再用三蒸水沖洗2次(清除殘留酸液)。

    3

    將爬片置于無水乙醇浸泡過夜(浸洗脂類污漬),75%乙醇長期保存備用(無需高壓滅菌)。使用時鑷子取出爬片,酒精燈烘烤,放入孔板。


    02

    細胞爬片

    1

    收集貼壁細胞進行計數,按照實驗需求用完-全培養基稀釋細胞至合適濃度。

    2

    加細胞前,先在每個孔里準備放爬片的位置滴加少量培養基(目的是使爬片與培養皿靠液體的張力粘合到一起),然后輕放爬片(注意不要產生氣泡,防止加細胞懸液時爬片漂起)。整個過程注意無菌操作。

    3

    根據實驗需求接種合適細胞量到培養器皿內。


    03

    爬片的固定

    固定液的選擇:

    1)多聚甲醛(常用4%)

    可用于免疫電鏡、免疫組化、免疫熒光以及TUNEL染色等。室溫固定15~30 min后可進行后續實驗。


    2)4%中性甲醛:

    又名“10%中性福爾馬林",應用廣泛,常用于免疫組化、免疫熒光以及TUNEL染色等。形態結構保存好,且穿透性強,但甲醛放置過久可氧化為甲酸,使溶液pH降低,影響染色;分子間交聯形成的網格結構可能部分或完-全掩蓋某些抗原決定簇,使之不能充分暴露,可能造成假陰性的染色結果。室溫固定15~30 min后可進行后續實驗。


    3)其他

    如冷丙酮、75%~95%乙醇等,具體的以實驗要求為準。


    以多聚甲醛為例進行固定:

    1

    準備4%多聚甲醛(PFA),于4℃冰箱中保存,使用時常溫復溫。

    2

    在培養板中將已爬好細胞的爬片用PBS浸洗3次,每次3 min,輕輕晃動,避免將細胞沖掉。

    3

    用4%的多聚甲醛固定爬片15 min(細胞自帶熒光時注意避光),PBS浸洗爬片3次,每次3 min。

    4

    Triton X-100(PBS配制,濃度根據實驗調整)室溫通透20 min。

    5

    PBS浸洗爬片3次,每次3 min。

    6

    按實驗需求進行后續實驗。




    04

    細胞爬片封片

    封片前根據實驗需求決定是否需要孵育抗體或復染核。孵育好后用PBS浸洗3次,用吸水紙吸干爬片上的液體,封片液封片。






    注意事項

    固定好的細胞爬片建議盡快用于實驗,以免影響實驗效果。

    取爬片時注意控制力度,夾取時盡量夾取爬片邊緣,以免夾破爬片或造成劃痕。

    細胞爬片取出后,一般用PBS潤洗3遍(潤洗操作盡量輕柔,以免細胞脫壁;根據研究目的,可調整潤洗次數,避免細胞脫壁),然后做固定。

    對于貼壁性較差的細胞,可提前用包被液(明膠,多聚賴氨酸,鼠尾膠原等)包被爬片。

    如果細胞帶有熒光標記,所有操作步驟盡量在較暗處進行。

    常見孔板細胞爬片(圓形)大小參考:

    爬片尺寸

    配套孔板

    直徑12 mm,厚度0.13~0.17 mm

    24孔板

    直徑18 mm,厚度0.13~0.17 mm

    12孔板

    直徑22 mm,厚度0.13~0.17 mm

    6孔板







    注:各個實驗室的操作流程都各有差異。此方案是我們實踐驗證可行的方案。




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